应用基因重排技术诊断淋巴瘤

复旦大学医学院附属中山医院病理科 副主任医师 医学博士 张王海 淋巴瘤是发生于淋巴组织的恶性肿瘤。淋巴组织由T、B淋巴细胞，组织细胞等免疫活性细胞组成。由于其组织学结构特殊，当它受到抗原刺激时能产生不同程度的反应性增生，淋巴结正常结构紊乱，免疫母细胞增生，核分裂相增多等假恶性图象。因此仅凭形态学观察有时很难确定其良、恶性。目前，一般病理科大约有70%左右的淋巴组织增生性疾病，凭常规切片可以明确诊断，约25%的病例。但对于无表面标记的早期未成熟细胞，或失去表面标记的异常细胞却无能为力。对反应性增生细胞成分较多的病例，瘤细胞即使有免疫表型也可能被掩盖。相反，由于操作等原因造成抗原扩散也可能造成假阳性。近年发展起来的克隆性基因重排检测技术为疑难、早期或微量标本确定诊断提供了可能，是对形态学检查和免疫组化方法的重要补充。 淋巴细胞表面具有与抗体或抗原特异性结合能力的一类有多个亚单位组成的糖蛋白，包括B淋巴细胞产生的IgH与IgL和T细胞产生的TCR(T细胞受体)。两者的基因编码相似，一般由可变区(V区)、多变区(D区)、连接区(J区)及恒定区(C区)构成。胚系状态下，这些区域在染色体上的分部是不连续的。V、D、J、C基因从5'端到3'端呈线状排列在DNA单链上，尚有长度不等的插入序列将其分开。当淋巴细胞发育到一定阶段，在特别的重组酶作用下，有选择地将它们连接起来(即基因重排)，才能构成一个有表达功能的基因。淋巴细胞从母细胞分化到成熟需要经过多次基因重排。由于V、D、J区均有多个可供选择的基因片段，使基因重排的自由度可达106~107之多。从个体上看，每个淋巴细胞的抗原或受体基因编码均有特定的基因重排形式，即独有的基因编码结构。如果T或B淋巴细胞在重排的某一阶段产生单克隆性增生即成为淋巴瘤。也就是说淋巴瘤细胞克隆性增生的结果，会使其特殊的基因重排形式占一定的数量优势。从而成为细胞克隆性的检测指标。这就是淋巴瘤基因诊断的理论基础。 目前，用于淋巴瘤基因重排分析的方法主要有两种。 一、 多聚酶链反应扩增技术(PCR) 此方法首先由美国Mullis等设计成功(1985年)。在1989年即有用于淋巴瘤基因疹断的报告。其原理是：选取IgH与TCR的V、D、J、C区基因编码中20个左右的保守核苷酸序列，人工合成一对或多对(家族基因)引说，与待测的模板DNA单链碱基互补，扩增目的DNA序列片段。如果是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良性增生性淋巴组织则出现弥漫涂片状，不行成单带。文献报告PCR基因诊断淋巴瘤，具有特异、敏感、快速等优点，且可用于新鲜组织和石蜡包埋组织。但目前用PCR方法检测基因重排较成功的仅是IgH基因。并且IgH基因重排的PCR检测方法也同样存在着两个明显的问题：1、影响因素多，稳定性欠佳。2、仍有10%以上的假阴性，灵敏度有待提高。 二、 Southern印迹杂交法 该方法首先由苏格兰爱丁堡大学Southern报告(1975年)。其原理是两条单链DNA碱基可与人工合成的互补单链DNA探针相结合(一般用同位素标记)。Southern Blot方法应用于基因重排检测是1981年Korsmeyer等首先进行的。将细胞DNA抽提出来，用限制性内切酶进行酶切，胚系DNA就会产生特征性片段。但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(>1~5%)，克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。 Southern分析已被应用于IgH、Igk、Ig1及各种TCR克隆性重排的检测，并以其令人满意的灵敏度和可靠性视为基因重排检测的"金标准"。但由于需要较大量(10mg)新鲜或冰冻组织，操作复杂、时间过长(约两周)，且需使用过射性同位素标记、易污染等缺点，仅适用于科研而不适用于临床诊断。 DAKO公司推出的荧光素标记IgH、Igk、Ig1及各种TCR探针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10分钟)，但敏感性并不降低，非常有利于在临床诊断中推广、应用。